En el desarrollo de esta investigación demostraremos la existencia de sitios de unión específicos de PAF en neutrófilos de bovino mediante análisis de radioligando utilizando 3H-PAF, y también que éste se encuentra acoplado a proteína G debido a la dependencia de GTP en su unión. Además, evaluaremos la capacidad de PAF de activar flujos de calcio y la importancia que posee la entrada de calcio extracelular. Junto con ello, describiremos los cambios de pH, acidificación intracelular, cambios de potencial y fluidez de membrana, que produce PAF. Describiremos la actividad tirosina quinasa inducida por PAF en neutrófilos de bovino mediante análisis por inmunoblot con anticuerpos anti - fosfotirosina, analizando a distintos tiempos y concentraciones, el efecto de PAF. Simultáneamente iniciaremos la descripción de la activación especifica de proteínas transductoras de senales del grupo de las MAP quinasas (mitogen activated protein), p38 y Erk 1/2. Finalmente, demostraremos que 14-deoxiandrografolido inhibe in vitro e in vivo la actividad de PAF a través del bloqueo de su receptor, lo que aportará evidencias sobre el mecanismo de acción antiinflamatorio en bovinos.

Los neutrófilos de bovino cumplen un rol fundamental en procesos inflamatorios e infecciones bacterianas mediante la generación de radicales superóxido, enzimas proteolíticas, y activación de proteínas que ejercen una función bactericida. Diversas substancias regulan la actividad del neutrófilo, y algunas actúan como factores quimiotácticos permitiendo que los neutrófilos migren desde el torrente sanguíneo a los tejidos. Uno de ellos, el factor agregante plaquetario (PAF, platelet activating factor, 1-0-alkyl-2(R)acetyl-glyceryl-3-phosphorylcholine) es un fosfolípido biológicamente activo liberado por plaquetas, leucocitos y células musculares lisas, mediante la ruptura de precursores lipídicos provenientes de la membrana plasmática. El PAF es un potente quimioatractante y mediador de la función de los neutrófilos. Se ha descrito en otras especies, que la activación en neutrófilos por PAF es mediada por un receptor de membrana acoplado a proteína G, y que su activación produce efectos rápidos, como liberación de calcio intracelular, influjo de calcio externo, cambios de potencial de membrana, como también actividad tirosina quinasa. Debido a la importancia de los neutrófilos en patologías inflamatorias de bovinos (p.e. mastitis, metritis y neumonías), a la escasa información disponible del receptor de PAF en esta especie, y al interés de nuestro grupo por la búsqueda de nuevas moléculas con actividad antagonista de PAF, planteamos en el presente proyecto evaluar que el posible efecto antiflamatorio de 14-deoxiandrografolido, sería mediado por el bloqueo específico de receptores a PAF en neutrófilos de bovino. En el desarrollo de esta investigación demostraremos la existencia de sitios de unión específicos de PAF en neutrófilos de bovino mediante análisis de radioligando utilizando 3H-PAF, y también que éste se encuentra acoplado a proteína G debido a la dependencia de GTP en su unión. Además, evaluaremos la capacidad de PAF de activar flujos de calcio y la importancia que posee la entrada de calcio extracelular. Junto con ello, describiremos los cambios de pH, acidificación intracelular, cambios de potencial y fluidez de membrana, que produce PAF. Describiremos la actividad tirosina quinasa inducida por PAF en neutrófilos de bovino mediante análisis por inmunoblot con anticuerpos anti - fosfotirosina, analizando a distintos tiempos y concentraciones, el efecto de PAF. Simultáneamente iniciaremos la descripción de la activación especifica de proteínas transductoras de senales del grupo de las MAP quinasas (mitogen activated protein), p38 y Erk 1/2. Finalmente, demostraremos que 14-deoxiandrografolido inhibe in vitro e in vivo la actividad de PAF a través del bloqueo de su receptor, lo que aportará evidencias sobre el mecanismo de acción antiinflamatorio en bovinos.